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发布时间:2022-11-08   来源:未知    
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可溶性可以以小分子状态溶于水或其他溶剂的蛋白。通常在植物生理、微生物、食品加工等实验中作为重要指标。蛋白是

植物抗旱性

的重要指标之一。今天栢晖生物就给大家分享一下如何通过

考马斯亮蓝染色法测定植物中的可溶性蛋白:

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试剂

所有试剂除注明者外,均为分析纯。

1.1 考马斯亮蓝溶液配制

:称取100 mg考马斯亮蓝,溶于50ml 90%乙醇中,加入100ml 85%(W/V)磷酸,再用蒸馏水定容到1L。在过夜后过滤并贮于棕色瓶中,常温下可保存一个月。

1.2 90% 乙醇

1.3 100 g/ml 牛血清蛋白(BSA)标准溶液

:称取10mg BSA定容至100 ml即为100 g/ml。或称取25 mg BSA加蒸馏水水溶解后定容至100 ml,再从中吸取40 ml蒸馏水定容至100ml。

1.4 0.05 mol/LpH7.8磷酸配制

A母液,0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4·12H2O (分子量358.14)35.85 g,用蒸馏水定容至500 ml。

B母液,0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液:取NaH2PO4·2H2O (分子量156.01)1.5601 g,用蒸馏水定容到50 ml。

1.5 0.05M pH7.8磷酸

:分别取A母液228.75ml,B母液21.25ml,用蒸馏水定容至1000ml。

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主要仪器

万分之一分析天平、紫外可见分光光度计、离心机

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试样的制备

取风干的实验室待测样品充分混匀后,籽粒全部通过 0.25mm(秸秆通过 0.5mm)孔径筛,装入样品瓶备用。

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分析步骤

4.1 试样溶液制备

样品提取:取鲜样0.2—0.5g,用蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后,3000r/min—4000r/min离心10min,上清液备用。

4.2 标准曲线绘制

取6支具塞试管,依次加入标液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml,然后用蒸馏水补充至1ml,再向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂,5min左右,以0号试管为空白对照,在595nm下比色测定吸光度,以蛋白质含量为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

4.3 样品的测定

吸取样品提取液1.0ml(视蛋白质含量适当稀释),放入试管中(每个样品重复两次),加入5ml考马斯亮蓝试剂,摇匀,放置2min待反应完成,在595nm下比色,测定吸光度,并通过标准曲线查蛋白质含量。

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结果计算

式中:

C—查标准曲线值,g;

Vt—提取液总体积,ml;

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WF—样品鲜重,g;

Vs—测定时加样量,ml

所得结果应保留小数点后三位

来源:成都栢晖生物整理

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